近日，上?？萍即髮WiHuman研究所、生命科學與技術學院水雯箐課題組聯合徐菲課題組，在國際學術期刊《美國化學會志》（Journal of the American Chemical Society）發表了題為“Structural Mass Spectrometry Captures Residue-Resolved Comprehensive Conformational Rearrangements of a G Protein-Coupled Receptor”的研究論文，發展了基于限制性蛋白酶切的質譜（LiP-MS）技術，在氨基酸位點分辨水平上全面描繪G蛋白偶聯受體（GPCR）在多種條件下的構象轉變與靈活性，為GPCR結合不同配體和G蛋白偶聯狀態下的結構動態性研究提供了新視角與新方法。
通過X射線晶體學或單顆粒冷凍電鏡技術解析的GPCR復合物三維結構，雖然極大加深了我們對GPCR激活機制的理解，但這些結構快照難以完整揭示GPCR在溶液相或者細胞生理環境中的動態構象變化。近年來，基于光譜的方法被應用于探測GPCR蛋白的構象動態性，但這些方法通常需要對某個位點進行標記，無法獲得全局性的構象變化信息。
本研究建立了一種基于LiP-MS的結構質譜技術（圖1），能夠同時監測GPCR在多個結構域上位點分辨的構象轉變，包括柔性的環狀區以及跨膜螺旋區。通過監測PK酶對各個位點的酶切可及性，本工作探究了腺苷2A受體（A2AR）在多種配體（2種激動劑、1種拮抗劑和3種別構調節劑）結合下以及與G蛋白偶聯過程中的構象動態變化。
圖1. LiP-MS技術的流程示意圖
通過與已解析的晶體結構對比，研究人員發現LiP-MS結果能精確反映配體結合和受體激活在多個結構域中的結構機制。例如，在正構配體作用下，受體第二個胞外環（ECL2）區域中多個位點、尤其是配體直接結合位點，均顯示出PK可及性降低，這表明該區域由于配體結合作用使其剛性增加。類似的區域還包括受體激活過程中關鍵的基序（如NPXXY）、G蛋白與受體互作界面中的第二個胞內環（ICL2）等。
基于LiP-MS的結構質譜分析也反映出已解析結構并未披露的局部構象動態性。如在G蛋白偶聯過程中，除了監測到ICL2前半段（對應G蛋白結合界面）和第六個跨膜螺旋（TM6）（對應受體激活核心區域）等的構象轉變，還發現受體ICL2后半段的動態性升高，而這點無法直接用已解析的晶體結構闡釋（圖2）。此外，本工作還研究了多種不同類別的配體對受體的構象擾動作用。以上研究證實，基于LiP-MS的受體結構指紋圖譜可以準確分類不同藥理學性質的配體，并區分G蛋白偶聯和非偶聯狀態。
圖2. LiP-MS捕捉G蛋白偶聯過程中的受體構象重排
綜上所述，本工作建立了一種新型結構質譜方法，用于在溶液中對GPCR的構象變化實現位點分辨、覆蓋多個結構域的全面解析。LiP-MS以其高靈敏度、高特異性和高通量，與當前GPCR結構和動態研究技術高度互補，能夠幫助我們深入理解GPCR復雜藥理學的結構基礎，并為基于結構的藥物發現提供新視角與新技術。
上?？萍即髮W生命科學與技術學院2021級博士研究生劉紅月與2021級碩士研究生嚴鵬飛為論文的共同第一作者。iHuman研究所研究員、生命學院常任副教授水雯箐與iHuman研究所研究員、生命學院常任教授徐菲為該工作的共同通訊作者。中國科學院上海藥物研究所的鄭杰研究員、復旦大學基礎醫學院周慶同研究員與上海交通大學醫學院張健教授作為合作者，為本研究提供了大力支持。上?？萍即髮W為第一完成單位。
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